人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞(HCCLM3)

用人肝癌細胞株MHCC97-H 接種裸鼠，進行3 次肺轉(zhuǎn)移篩選，取肺轉(zhuǎn)移瘤建成皮下接種后高度自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的肝癌細胞系。

1）來源：肝癌

2）形態(tài)：上皮細胞樣，胞質(zhì)內(nèi)有顆粒

3）含量：>1x106 個/mL

4）污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

5）規(guī)格：T25 瓶或者1mL 凍存管包裝

運輸和保存：可選擇干冰運輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細胞方式：（1）干冰運輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇；（2）存活細胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長，傳代達到細胞生長狀態(tài)良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養(yǎng)步驟。

人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞(HCCLM3)用途：僅供科研使用。

人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞(HCCLM3)培養(yǎng)步驟:

一．人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞(HCCLM3)培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備DMEM 培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO，貨號11965-092)；北美胎牛血清(United States，GIBCO，貨號16000-044)，10%；雙抗1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37 攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL 細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，補加1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)?/span>細胞懸液加入10cm 皿中，加入約8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS 潤洗細胞1-2 次。

2. 加2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，補加1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2 到1：5 的比例分到新的含8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。

下面T25 瓶為例；

1．細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗瓶底1-2 次后加入1ml 胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml 完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2．1000RPM 離心5 分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO 至最終濃度為10%。加入DMSO 后迅速混勻，按每1ml 的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數(shù)目大于1X106 個細胞凍存。

3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，至少2 個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

注意事項：

1. 收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

2. 所有動物細胞細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

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