體外培養(yǎng)細(xì)胞除可直接觀察活細(xì)胞外，還可以用固定細(xì)胞的方法將細(xì)胞制成永久標(biāo)本進(jìn)行觀察。固定染色觀察，既可顯示細(xì)胞形態(tài)，也可揭示細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的觀察技術(shù)。其基本技術(shù)為固定染色和觀察。
一、細(xì)胞固定基本方法
無(wú)論用雙蓋片懸浮培養(yǎng)、加蓋片單層培養(yǎng)還是懸液培養(yǎng)，都能將細(xì)胞固定染色，其中以蓋片培養(yǎng)最常用。其步驟為：
（1）培養(yǎng)時(shí)加入一清潔蓋片。
（2）待蓋片長(zhǎng)滿細(xì)胞或所需的適宜時(shí)期用鑷子輕輕取出蓋片，迅速投入37℃Hanks液中漂洗兩次，每次3～5秒鐘，以洗除血清防止其妨礙染色；如用懸液培養(yǎng)的細(xì)胞時(shí)，需離心(800rpm)，除去含血清的培養(yǎng)液，再向沉降細(xì)胞中加入少許溫Hanks液，用吸管輕輕吹打漂洗后，留少許懸液，再做涂片，涼干后固定。
（3）固定 將上述玻片浸于固定液15分鐘。常用的固定劑有甲醇/醋酸、FAA固定液、Carnoy。甲醇/醋酸濃度為甲醇3分，冰醋酸1分，現(xiàn)用現(xiàn)配，適用于觀察染色體和Giemsa染色。FAA固定液濃度為：80%酒精90.0mL，冰醋酸5.0mL，中性福爾馬林(40%甲醛，用時(shí)向瓶中加過量MgCO3中和)5.0mL。適用于蓋片單層培養(yǎng)，固定效果好。Carnoy是較好的非水溶性固定液，濃度為純酒精60.0mL，氯仿30.0mL，冰醋酸10.0mL，適用于顯示細(xì)胞化學(xué)成分等方法，如粘多糖等，對(duì)固定培養(yǎng)單層細(xì)胞效果很好。但穿透力差。
二、常用染色方法
1、H．E(蘇木精一伊紅)染色法
H．E染色法是細(xì)胞化學(xué)染色方法中最常用的一種方法。其基本原理是用堿性染料蘇木精和酸性染料伊紅分別與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)發(fā)生作用，使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)通過顏色而改變它的折射率，從而在光鏡下能清晰地呈現(xiàn)出細(xì)胞圖像，并能提供良好的核漿對(duì)比染色。
染色的基本材料為：
蘇木精染液
蘇木精 0.5g
溶于70mL蒸餾水中
銨礬(NH4)2SO4AL2(SO4)3 24.0g
H2O 5.0mL 再加入甘油30mL和冰醋酸2mL混合均勻，
NaIO3 0.1g 濾紙過濾備用。
伊紅 0.5g 溶于100.0mL蒸餾水中。
染色過程為：樣品制備、染細(xì)胞核、染細(xì)胞質(zhì)、脫水、透明和封固等。注意貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用蓋玻片培養(yǎng)法制備樣品；懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞用離心甩片機(jī)制備樣品。
染色的步驟(蓋片培養(yǎng)法為例)：
（1）用鑷子輕輕取出已在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)一段時(shí)間，細(xì)胞基本長(zhǎng)成單層的蓋玻片，用37℃溫PBS漂洗3次，每次20秒～1分鐘；
（2）將蓋玻片浸入中性福爾馬林30分鐘；
（3）PBS洗2次，每次1分鐘，蒸餾水漂洗1次，浸入用蒸餾水稀釋的蘇木精液(1/20)染色10分鐘；
（4）自來水浸洗，置入1%NaHCO3液中洗至藍(lán)紫色；
（5）伊紅水溶液中染30秒～1分鐘；
（6）蒸餾水洗，迅速通過丙酮2次，每次3～5分鐘；
（7）通過2:1丙酮/二甲苯3次，每次1～2分鐘；
（8）通過1:2丙酮/二甲苯3次，每次1～2分鐘；
（9）通過純二甲苯5～10分鐘；
（10）把蓋片細(xì)胞面向上，置載物玻片上，用樹膠封存，再覆以較大蓋片。
也可以用95%酒精作為固定液，用稀鹽酸酒精溶液(75%酒精配制1%鹽酸)作為分色液，用淡氨水溶液(在400mL自來水中滴2滴濃氨水)使胞核藍(lán)化。其染色的基本步驟為：
①將有細(xì)胞的蓋玻片用溫PBS洗3次后，浸入95%酒精固定15分鐘。
②PBS洗2次，每次1分鐘，然后浸入蘇木精染液，染色5～10分鐘。
③自來水浸洗后，浸入稀鹽酸酒精溶液，數(shù)秒鐘，進(jìn)行分色。
④自來水浸洗后浸入淡氨水中3～5分鐘，使胞核藍(lán)化。
⑤自來水浸洗后浸入伊紅染液，染色5～10分鐘。
⑥自來水浸洗，經(jīng)70%、80%、90%酒精各1次，95%酒精2次和100%酒精3次逐級(jí)脫水，每次1分鐘。
⑦通過二甲苯3次，每次1分鐘。
⑧在載玻片上滴加中性樹膠，將有細(xì)胞一面的蓋玻片向下封固于載玻片上。
光鏡下觀察，細(xì)胞呈粉紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色。
2、Giemsa染色法
Giemsa染色也是最常用的染色方法之一，適用于多種細(xì)胞和染色體染色。其主要用Giemsa染液可將細(xì)胞核染成紫紅色或藍(lán)紫色，胞漿染成粉紅色，在光鏡下呈現(xiàn)出清晰的細(xì)胞及染色體圖像。
Giemsa染色的基本材料為：
Giemsa粉0.5g，甘油22mL，將Giemsa粉置于研缽內(nèi)先用少量甘油與之充分混合，研磨至無(wú)顆粒；然后將剩余的甘油混在一起，56℃保溫2小時(shí)后，加入33mL純甲醇，保存于棕色瓶?jī)?nèi)。
染色的基本步驟為：
（1）準(zhǔn)備染液：用pH6.81～7.38的Sorensen緩沖液，按1:9比例取Giemsa染液和Sorensen緩沖液混合配成染色液；
Sorensen緩沖液的配制：
pH6.81：Na2HPO4(1/15M) 50mL + KH2PO4(1/15M) 50mL;
pH6.98：Na2HPO4(1/15M) 60mL + KH2PO4(1/15M) 40mL
pH7.17：Na2HPO4(1/15M) 70mL+ KH2PO4(1/15M) 30mL；
pH7.38：Na2HPO4(1/15M) 80mL + KH2PO4(1/15M) 20mL。
(2)細(xì)胞標(biāo)本用甲醇固定10分鐘，或用1:3醋酸/甲醇固定30分鐘，用滴管把染色液布滿玻片上，注意不要有氣泡，用染色缸染色亦可，染10～15分鐘；
(3)用自來水沖去玻片上多余的染料，自然干燥，二甲苯透明，光學(xué)樹脂膠封固。
染色液宜現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時(shí)間不超過48小時(shí)。緩沖液pH值要準(zhǔn)確，否則影響染色效果。用染色缸染色前應(yīng)先用小片濾紙刮除液面的氧化后，再進(jìn)行染色。染色完畢將標(biāo)本浸入水中洗除染液。
Giemsa染色光鏡下觀察細(xì)胞核呈紫紅色或藍(lán)紫色，細(xì)胞漿成粉紅色。
三、特殊染色方法
隨著組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞染色方法也有了較大的發(fā)展。為了能夠鑒別細(xì)胞中的DNA，Feulgen于1924年提出了Feulgen染色法。有些科學(xué)家把血清學(xué)方法和顯微示蹤方法結(jié)合起來又形成了免疫細(xì)胞化學(xué)染色法，如免疫熒光染色法和免疫酶染色法，這些為進(jìn)一步分辨細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)提供了更為先進(jìn)的手段和技術(shù)。
(一)Feulgen染色法
此法的基本原理是細(xì)胞中的DNA在60℃用1N HCl酸解離脫氧核糖核酸，使嘌呤堿基與糖苷鍵破壞，嘌呤堿脫掉，脫氧核糖中的醛基游離，醛基能與Schiff試劑相結(jié)合，形成一種紫色的復(fù)合物。
1、Feulgen染色的基本材料：
(1)1N HCl：用濃HCl 8.5mL+蒸餾水91.5mL稀釋。
(2)Schiff氏劑：將堿性品紅0.5g加入到100mL煮沸的蒸餾水中，再煮3～5分鐘，冷卻，過濾；冷卻至25℃時(shí)，再加入1NHCl 10mL，偏重亞硫酸鈉1.5g，裝入棕色瓶中，蓋緊，黑紙包裹存于暗處；漂洗液用10%亞硫酸鈉溶液10.0mL加蒸餾水200.0mL，1N HCl 10.0mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、Feulgen染色的基本步驟：
(1)將細(xì)胞置入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)一段時(shí)間，將長(zhǎng)成單層的蓋玻片取出，用Carnoy或醋酸/甲醇固定20～30分鐘。
(2)室溫下置入1N HCl 1～2分鐘。
(3)再投入60℃ 1N HCl 8～10分鐘。
(4)在10℃暗處投入Schiff劑中染色1～5分鐘。
(5)取出在漂洗液中漂洗2次，每次2分鐘。
(6)在蒸餾水中漂洗2次，每次2分鐘。
(7)用75%→100%的酒精依次脫水，每次1分鐘。
(8)用二甲苯透明2次，每次3分鐘。
(9)用樹膠封片，封實(shí)后蓋片上加微型重物加壓，置數(shù)日，樹膠干后觀察。
本方法中酸的離解是關(guān)鍵，溫度過低或酸度不夠，醛基暴露不充分，染色會(huì)過淺；反之，酸解過分，導(dǎo)致DNA完全解聚，染色反應(yīng)會(huì)減弱。細(xì)胞中RNA對(duì)酸比較穩(wěn)定，醛基難游離，不被著色，故此法能對(duì)DNA進(jìn)行特異性染色。
Feulgen染色后，細(xì)胞核成粉紅色至紫紅色，胞質(zhì)為無(wú)色。
(二)免疫熒光染色法
此法基本原理是將已知抗體或抗原標(biāo)記熒光素，用此特異性試劑，浸染含有相應(yīng)抗原或抗體的組織細(xì)胞標(biāo)本，借助抗原抗體的特異性結(jié)合，于抗原或抗體的存在部位呈現(xiàn)熒光，從而可以定位標(biāo)本內(nèi)的抗原或抗體。
1、主要使用材料
(1)0.01mol/L PBS 稱取NaCl 8g，Na2HPO4. 15g，KH2PO4 0.2g,加蒸餾水至1000mL溶解后，調(diào)pH至7.2。
(2)0.5mol/L硫酸鹽緩沖液(CB) 稱取NaHCO3 3.7g，Na2CO3 0.6g，加蒸餾水至1000mL，溶解后調(diào)pH至9.5。
(3)50%緩沖甘油 1分純甘油加1份CB。
(4)伊文氏藍(lán)溶液 稱取伊文氏藍(lán)1g，加入100mL PBS中，溶解后加1mL 1%NaCO3過濾；4℃保存。臨用前取0.1mL，加9.9mL PBS稀釋成0.01%濃度使用。
(5)特異性抗體(第一抗體) 熒光素標(biāo)記抗體（第二抗體）。
(6)染色缸、濕盒、振蕩儀、熒光顯微鏡。
2、染色的基本步驟
(1)細(xì)胞準(zhǔn)備 將7mm×22mm蓋玻片置入培養(yǎng)瓶中，加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，取出蓋玻片，用PBS洗2次；懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞離心后用PBS離心洗滌2次，制成細(xì)胞涂片。
(2)細(xì)胞固定 用醋酸/甲醇或95%酒精固定20～30分鐘。
(3)將固定的細(xì)胞玻片置入蓋片染色缸，用PBS振洗5分鐘，取出吹干。
(4)滴加稀釋的熒光素標(biāo)記抗體(0.01%伊文氏藍(lán)溶液稀釋)，在濕盒中37℃保溫30～60分鐘。
(5)PBS振洗2次，每次5分鐘，然后用蒸餾水振洗1次。
(6)用50%緩沖甘油封片。
標(biāo)本染色后應(yīng)及時(shí)觀察并照相，若暫時(shí)無(wú)時(shí)間觀察則應(yīng)將標(biāo)本放入4℃冰箱保存。但過夜后特異性熒光會(huì)減弱。如用聚乙稀醇封片，則保存時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。制標(biāo)本和染色時(shí)必須設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照及抑制試驗(yàn)，以排除非特異性染色。要控制顯色反應(yīng)時(shí)間，以陽(yáng)性反應(yīng)著色最強(qiáng)，而有的是剛開始著色為佳。滴加抗體的量要適當(dāng)，防止液體干涸。
此種染色法在熒光顯微鏡下觀察，陽(yáng)性部位出現(xiàn)熒光。熒光素種類不同可出現(xiàn)不同顏色的熒光。如異硫氰酸熒光素呈黃綠色熒光，羅丹明B220呈橙紅色熒光。
(三)免疫酶染色法
ABC免疫酶染色法即卵白素—生物素—酶復(fù)合物法，是目前最敏感的免疫細(xì)胞化學(xué)染色法之一。其基本原理是將特異性第一抗體與組織細(xì)胞相應(yīng)抗原結(jié)合后，通過生物素化橋抗體與第一抗體結(jié)合，借助卵白素與生物素的天然親和性將生物素化辣根過氧化酶連接為復(fù)合物，通過酶促反應(yīng)，顯示組織細(xì)胞相應(yīng)的抗原。此法靈敏性高，對(duì)比度佳。
1、使用的主要材料
磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L, pH7.4 PBS)；Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L, pH7.6 THB)；底物溶液[臨用前稱取50mg3.3'二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，溶解于100mL THB中，過濾，然后加20uL 30%H2O2，及時(shí)使用]；ABC試劑盒(美國(guó)VECTOR公司產(chǎn)品，包括正常馬血清、生物素化馬抗小鼠IgG或馬抗兔IgG、卵白素—生物素化辣根過氧化物酶復(fù)合酶)；小鼠(兔)特異性抗體；蓋片染色缸、濕盒、顯微鏡等。
2、染色的基本步驟
(1)細(xì)胞準(zhǔn)備與固定，同免疫熒光染色法.
(2)取已固定的細(xì)胞蓋片,用PBS洗5分鐘,浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 5mL+PBS 200mL) 37℃3分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。
(3)PBS振洗2次，每次3分鐘。
(4)滴加正常馬血清，在濕盒內(nèi)，37℃保溫30分鐘，以消除非特異性染色。
(5)棄去正常馬血清，滴加小鼠特異性抗體，在濕盒內(nèi)37℃保溫30～60分鐘或4℃下過夜。
(6)PBS振洗3次,每次3分鐘,滴加生物素化馬抗小鼠IgG，在濕盒內(nèi)37℃30分鐘。
(7)PBS振洗3次，每次3分鐘，滴加ABC復(fù)合劑，在濕盒內(nèi)37℃30分鐘。
(8)PBS振洗2次，THB振洗1次，每次3分鐘，浸入新鮮配制的底物溶液，在室溫下置暗處10～20分鐘。
(9)自來水洗5分鐘(若采用顯微分光光度計(jì)進(jìn)行定量分折，則無(wú)需作細(xì)胞核襯染，直接進(jìn)行脫水、透明和封片)。
(10)細(xì)胞核襯染 浸入蘇木精染液染色2分鐘，自來水洗，迅速過鹽酸酒精溶液，自來水洗，過氨水溶液，自來水洗。
(11)逐級(jí)脫水 過70%酒精1次，95%酒精2次，無(wú)水乙醇3次，每次1分鐘。
(12)透明，過二甲苯溶液3次，每次1分鐘。
(13)將有細(xì)胞的面向下，用中性樹脂封片。
此種染色方法同免疫熒光染色一樣，也應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照和抑制試驗(yàn)。空白對(duì)照用PBS做第一抗體。抑制試驗(yàn)是將待檢標(biāo)本與未標(biāo)記特異性抗體反應(yīng)后，再用自己標(biāo)記的特異性抗體進(jìn)行染色，結(jié)果陽(yáng)性強(qiáng)度減弱或轉(zhuǎn)為陰性。其注意事項(xiàng)同免疫熒光染色法。
此法染色結(jié)果在光鏡下觀察，陽(yáng)性部分呈棕褐色。
(四)細(xì)胞銀染色法
此法用于嗜銀蛋白分析。其基本原理是：核仁形成區(qū)(nucleolar organizer regions NORs)是位于某些近端著絲染色體短臂上含編碼核蛋白體RNA(rRNA)基因rDNA片段的環(huán)狀DNA。這個(gè)區(qū)存在的相關(guān)嗜銀蛋白(Ag NORs)是核仁內(nèi)高度磷酸化，并對(duì)銀有親和作用的酸性非組蛋白，對(duì)rDNA的轉(zhuǎn)錄、rRNA合成、加工和裝配起著重要的作用。AgNORs的含量可反映細(xì)胞增殖活性，其含量越高，表明細(xì)胞增殖越快。用銀染色法能特異顯示細(xì)胞AgNORs，通過計(jì)數(shù)AgNORs顆粒和測(cè)量AgNORs面積，可定量分析細(xì)胞AgNORs。
1、銀染色法需要的基本材料
50%硝酸銀和1%甲酸(v/v)需用去離子水配制；2%明膠甲酸溶液(稱明膠2g，溶入1%甲酸溶液100mL)；應(yīng)用染色液(在暗室內(nèi)將2%明膠甲酸溶液和5%硝酸銀溶液按1:2的容積比混合)需在染色前新鮮配制；潔凈的蓋片染色缸、吸管、載玻片、鑷子等。
2、染色的基本步驟
(1)細(xì)胞準(zhǔn)備與固定同前。
(2)固定后的細(xì)胞玻片浸入去離子水中使其水化。
(3)將應(yīng)用染色液滴加于細(xì)胞玻片上，室溫下避光染色1小時(shí)。
(4)用去離子水反復(fù)沖洗，95%～100%系列酒精脫水。
(5)用二甲苯透明。
(6)中性樹脂封片。
染色液配制一定要用去離子水。注意染色時(shí)間，不同組織標(biāo)本染色時(shí)間不同，其長(zhǎng)短直接關(guān)系到AgNORs顆粒的計(jì)數(shù)結(jié)果，特別要注意。計(jì)數(shù)時(shí)每例樣本不得少于30個(gè)細(xì)胞數(shù)。
染色片在光鏡下可見到細(xì)胞核內(nèi)散著大小不等的黑色顆粒。定量分析可用目鏡形態(tài)定量學(xué)方法和自動(dòng)圖像分析法。前者采用0.5網(wǎng)形目鏡測(cè)微尺測(cè)量細(xì)胞核AgNORs顆粒數(shù)，以相互不連的顆粒定為一個(gè)計(jì)數(shù)點(diǎn)。后者采用圖像分析儀自動(dòng)定量分析，先在光鏡下對(duì)待核細(xì)胞定位，通過攝像系統(tǒng)將細(xì)胞圖像信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)對(duì)每一視場(chǎng)的顆粒個(gè)數(shù)及每一顆粒面積進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別和計(jì)數(shù)。
(五)考馬斯亮藍(lán)(Coomassie, BB)染色法
這是一種顯示細(xì)胞骨架、細(xì)胞內(nèi)微絲的染色方法。
1、需用的材料
固定液[0.1mol/L磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)14.0mL, 0.1N磷酸氫二鈉(NaH2PO4·12H2O)36.0mL，加蒸餾水50.9mL，相混合后再加25%戊二醛50.0mL]；染色液(甲醇46.5mL，冰醋酸7.0mL，加蒸餾水46.5mL，相混合后加考馬斯亮藍(lán)染料0.02g)。
2、染色的基本步驟
(1)細(xì)胞準(zhǔn)備 用支持物蓋片培養(yǎng)法，待細(xì)胞長(zhǎng)滿70～80%。
(2)將有細(xì)胞的蓋片從培養(yǎng)瓶中取出，投入固定液中固定15分鐘。
(3)先置蒸餾水漂洗2分鐘，再用蒸餾水沖洗兩次，每次1分鐘。
(4)置入考馬斯亮藍(lán)染液中染色60分鐘。
(5)先置蒸餾水漂洗2分鐘，再用蒸餾水沖洗兩次，每次1分鐘。
(6)置入含甲醇冰醋酸液碟皿中(不含染料)，在倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)微絲逐漸明顯，背地清亮?xí)r終止。
(7)按(3)方法漂洗。
(8)用70%～100%酒精逐級(jí)脫水。
(9)用二甲苯透明。
(10)用樹膠封固。
染色清晰的關(guān)鍵在第(6)步，要特別注意。染色片鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)微絲呈現(xiàn)藍(lán)色。
